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미생물 생산 폴리에스터-무기 하이브리드의 특성
(SEN'I GAKKAISHI Vol.65, No.6(2009)
福井대학 대학원 中根幸治 외 4인
1. 서언
많은 미생물은 저장물질로서 체내에 다양한 polyhydroxyalkanoate(PHA)를 합성한다. PHA는 열가소성으로 성형이 용이하고, 또한 환경 미생물에 의해 완전히 생분해되기 때문에 환경부하 저감형 플라스틱으로 주목받고 있다(1). 그 대표 적인 것으로 poly-3-hydroxy lactic acid가 있으나, 이 이 재료는 매우 약하다는 결점이 있다. 이를 개선하기 위해 미생물에 부여하는 탄소원을 개량해 다양한 물성을 나타내는 공중합 폴리에스터가 개발되고 있다(2). Poly-3-hydroxy lactic acid(3HB)-3-hydroxy valeric acid(3HV) 공중합체[P(3HBV)]는 그 대표적인 것이다(3). P(3HBV)는 영국의 ICI사에 의해 출시되었으나, 생산코스트가 높기 때문에 상품개발이 진행되지 못했다(2). 그러나 2003년 중국에서 저가의 전분자원을 주원료로 한 P(3HBV) 생산이 개시되어 향후 P(3HBV)의 이용확대가 예상된다(5).
본 연구에서는 P(3HBV)의 고성능화와 고기능화를 목적으로 P(3HBV)와 무기성분인 titan tetraisopropoxide(TP)의 hybrid film을 성형하고 TP가 P(3HBV)의 특성에 기여하는 효과를 조사하였다.
생분해성 고분자/무기 복합계에는 다양한 조합이 보고되어 있으나, 무기성분으로서 clay와 같은 층상화합물을 이용하는 intercalation에 의한 폴리머와 복합화하려는 예는 매우 많다(6, 7). 본 연구에 사용된 TP와 같은 금속 alkoxide를 이용하면 무기성분을 분자수준에서 폴리머와 하이브리드화 할 수 있다(8). Rhee 등은 tetraethoxysilane (TEOS)와 초산칼슘을 이용해 poly(ε-caprolactum-silica hybrid를 형성, 높은 생체활성을 나타내는 것으로 보고하고 있다(9, 10). Barun 등은 TEOS를 이용해 bacteria- cellulose silica hybrid를 형성, 구조와 열 특성을 조사하고 있다(11). 필자 등은 천이금속(Zr, Ta) alkoxide와 초산셀룰로오스의 상호작용을 이용해 겔 섬유를 형성, 효소고정화용 담체와 무기섬유 전구체로의 이용을 보고하고 있다(12, 15). 또 polybutylene succinate/초산셀룰로오스 브랜드계, 폴리 L 유산/초산 셀룰로오스 브랜드계에 TP를 첨가하면 투명한 브랜드필름을 얻을 수 있기 때문에 TP가 상용성제로 작용한다는 것이 보고되고 있다(15-18). 이들은 금속 알콕사이드의 높은 반응성에 의한 것이다. 이상과 같이 P)3HBV)와 TP의 하이브리드화는 가능하다고 생각된다. 또 티탄은 생체적합성이 우수하기 때문에(19) 얻어진 하이브리드도 생체적합성이 우수한 재료가 될 것으로 기대된다.
2. 실험
2.1 시료
Poly-3-hydroxy lactic acid(3HB)-3-hydroxy valeric acid(3HV) 공중합체[P(3HBV)]는 ICI Bioronduct & Fine Chemicals, UK의 Biopol(Grade D411G, 펠렛상)을 사용하였다. 본 P(3HBV)는 평균분자량이 약 40만(GPC), 3HV 함유율 8.18%(H-NMR)이었다. TP는 Nacalai tesk제를 이용하였다.
2.2 P(3HBV)-TP 하이브리드의 성형
P(3HBV) 팰릿 10g, 클로로포름 100ml로 용해한 후, 클로로포름용액의 3배량의 헵탄을 가해 decantation을 행하고 에탄올로 두 번 세정하였다. 정제한 P(3HBV) 10g을 클로로포름 10ml에 용해한 후 소정량의 TP를 첨가, 약 5분간 혼합하면서 그라스 샤레에 cast 하고, 실온에서 건조시켜 백색의 P(3HBV)-P 하이브리드 필름을 얻었다. 필름은 진공건조한 후 데시케이터 내에서 1주간 이상 보존한 후 각 측정에 이용하였다.
3.2 구조, 물성의 평가
P(3HBV)-TP 용액의 점도측정에는 山一(야마이찌)전기의 진동식 점도계 비스코메이트(VM-1G)를 이용하였다(측정온도 20℃). P(3HBV)-TP 용액의 NMR 측정에는 일본전자의 Fourier 변환 핵자기 공명분석장치(JEOL LA-500)을 이용하였다. 용매는 CDCl3, 관측주파수는 125MHz, chemical shift는 TMS 기준으로 하였다. P(3HBV)-TP 필름의 DSC 측정에는 島津(시마쯔)시차주사열량계(DSC-60)를 이용하였다. 또 인장시험에는 東洋볼드윈의 텐션형 인장시험기(TENSILON/UTM-Ⅱ-20)을 이용하였다.
2.4 생체활성의 평가
P(3HBV)-TP 필름(3×5cm)를 유사액체(SBF) 200ml(36.5℃)에 침적하였다. 1주일 후 필름을 SBF로부터 꺼내 증류수로 세정해 진공 건조하였다.
증류수 1.0L에 다음에 나타내는 시약을 36.5℃시켜 용해시켜 1M-NCl을 이용해 pH7.40으로 조정한 용액을 SBF로 사용하였다. SBF에 사용된 시약은 다음과 같이[9, 20) : NaCl 136.8mmol, NaHCO3 4.2mmol, KCl 3.0mmol, K2HPO4․3H2O 1.0mmol, MgCl2․6H2O 1.5mmol, CaCl2 2.5 mmol, Na2SO4 0.5mmol.
SBF 침적 후의 필름 표면의 SEM 관찰에는 日立(히다찌)제작소의 S-2300을 이용하였다. 또 시마쯔 Fourier 변환 적외분광 광도계(FT-IR 8300)을 이용해 IR-ATR 스펙트럼을 측정하였다(분해능 4cm-1, 적산회수 40회)
2.5 생분해성 평가
알칼리 가수분해
각 필름 0.1g을 0.1N 수산화나트륨 수용액(40℃)중에 침적시켰다. 소정 시간 후 필름을 꺼내 증류수로 세정하고 진공건조한 후에 중량을 측정하였다. 기존 중량은 다음가 같이 산출한 [잔존중량(wt%)=(침적후의 중량/침적 전의 중량)×100].
가수분해 후의 잔존시료의 분자량 분포 측정은 東ソウ(토오소오)의 HLC-8220GPC를 이용하였다. 가수분해 후의 잔존시료를 클로로포름에 1g/L 농도로 용해시켜, 전용필터를 이용해 불순물을 제거하면서 GPC 측정에 이용하였다. 측정조건은 이동상유속 0.5ml/min(클로로포름), 측정용액 주입량 20㎕, 칼럼 온도 40℃로 하였다. 장치의 calibration은 9종류의 분자량이 다른 단분자 표준 폴리스티렌을 이용해 행하였다.
미생물 분해
생물화학적 효소산소요구량(BOD)를 TAITEC사의 BOD TESTER-100으로 측정하였다. 각 필름 18mg을 시험수(25℃, 200ml)로 소정시간 침적시킴으로서 미생물분해를 행하였다. 시험 水는 米泥(코메자와)세정수 관리센터(山形縣 米泥市 : 산케이현 코베자와 시)의 활성오니로부터 채취한 1.0×104개/ml의 미생물과, 다음에 소개하는 무기염 원액으로 조제하였다 : A 수용액(KH2PO4 8.5g/L, K2HPO4 21.75g/l, Na2HPO4․2H2O 33.30g/L, NH4Cl 1.7g/L), B 수용액(MgSO4․7H2O 22.5g/L), C 수용액(CaCl2, 27.50g/L), D 수용액(FeCl3․6H2O 0.25g/L)(A~D를 혼합해 무기염 원액으로 한다).
3. 결과 및 고찰
3.1 P(3HBV)와 TP의 상호작용
그림 1에 (A)P(3HBV) 용액과 (B)P(3HBV)-TP(30/70wt%) 혼합용액의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다(티탄과 상호작용을 보이기 때문에 TP량을 많이 하였다. 169.1ppm 부근의 피크는 3HB 중의 카르보닐기의 탄소원자에 상당하는 피크가 있으나, 혼합용액에서는 저 자장 측에도 피크가 보인다(169.5ppm 부근). 이로서 카르보닐기 중의 산소원자가 티탄에 배위한 것으로 생각된다. 또 67.5ppm의 강한 피크는 3HB의 3번 위치의 탄소원자에 의한 것이나, TP 혼합으로 이 피크 주변에 새로운 피크가 보인다. 저 자장측은 TP중의 티탄원자에 배위한 피크, 高자장측은 폴리머 쇄가 절단한 TP의 차단에 의한 피크로 판단할 수 있다(TP 단독의 13C-NMR 스펙트럼에서는 이런 피크는 보이지 않았다).
용액의 점도는 P(3HBV)-TP(90/10wt%) 혼합ㅇㅇ액이 최대값을 나타내었다. P(3HBV)용액, TP 10wt% 혼합용액의 점도는 각기 33.95mPa․s 이고, TP 40wt% 혼합용액에서는 26mPa․s 까지 낮아졌다. 이로서 P(3HBV)와 TP 사이에는 강한 상호작용이 있으나, TP 량이 많아지면 폴리머 주쇄의 에스테르 결합의 절단이 현저하게 일어나는 것으로 생각된다.
이상으로 P(3HBV)-TP 하이브리드는 폴리머 가교와 분해가 공존하고 있다고 생각된다. 가교의 경우 그림 2와 같이 P(3HBV)의 카르보닐기 중의 산소원자가 티탄에 배위해 6배위가 되는 구조를 생각할 수 있다. 이러한 상호작용으로 본 하이브리드는 P(3HBV) 매트릭스에 TP가 분자수준으로 존재하고 있는 것으로 생각된다.
3.2 하이브리드 열․역학특성
그림 3에 각 시료의 DSC 곡선을 나타내었다. 각 시료에 두 개의 열적 피크가 보여, 승온속도를 변화시켜 측정한 결과 저온측이 제막 중에 형상된 P(3HBV) 결정에 기인하는 융해피크, 고온측이 가열 중에 생기는 P(3HBV) 결정에 기인하는 융해피크인 것으로 판단되었다. TP20wt% 이상에서는 저온 측 피크가 작아지고, 또한 저온 측으로 쉬프트 되고 있기 때문에 제막 중 P(3HBV)의 결정화가 저해되고 있다고 생각된다. 광각 X 선 회절에서도 TP20wt% 이상의 첨가로 P(3HBV)의 결정화가 저해되는 경향이 보였다.
그림 4는 각 시료의 응력-뒤틀림 곡선으로부터 얻어진 초기 탄성율과 파단신도를 나타낸 것이다. TP 함유율의 증가에 따라 초기 탄성률이 서서히 상승하고 파단신도는 저하하였다. TP 함유율 30wt%에서는 취화가 되어 필름으로 취급은 곤란하였다.
3.3 하이브리드 생체활성
재료의 생체활성 평가로, SBF 중에 재료를 침적, 그 표면에 하이드록시 아파타이트(인산칼슘)를 자연 석출시키는 방법이다[9, 10, 21, 22].
그림 5는 SBF 침적 후(36.5℃, 1주간)의 (A)P(3HBV) 단독 필름, (B)TP20wt% 하이브리드 필름 표면의 SEM 사진을 나타낸 것이다. (A)에서는 침적 전에서는 보이지 않았던 백색입자가 필름 표면에 점점이 나타난 것에 반해 (B)에서는 백색입자가 전체를 덮고 있다.
그림 6은 SBF 침적 전후(36.5℃, 1주간)이 하이브리드 필름의 IR-ATR 스펙트럼을 나타낸 것이다. P(3HBV) 단독 필름의 경우 침적 후에 폴리머 피크 외에 1040cm-1 부근에 인산칼슘의 인산이온에 의한 피크가 보인다[9]. 한편 TP10, 20wt%의 하이브리드에서는 침적 후에 폴리머피크는 소실되고 인산이온의 피크만 보이기 때문에 인산칼슘이 필름 전체를 덮고 있다고 생각된다(그림 5 중 백색입자). TP를 첨가한 P(3HBV)는 TP의 알콕시기가 가수분해 되어 생성된 수산기가 많이 존재한다. 이 수산기에 SBF 중의 칼슘이온이 끌어당기고, 이어 인산이온, 수산화물 이온이 결합해 인산칼슘이 핵형성이 유도되기 때문에 인산칼슘 생성량이 증가한 것으로 생각된다. 이상과 같이 P(3HBV)에 TP를 첨가함으로서 P(3HBV)보다 생체활성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
3.4 하이브리드의 생분해성
그림 7은 알칼리 가수분해시험 결과를 나타낸 것이다. TP를 첨가함으로서 중량감소가 커지고, P(3HBV)의 분해가 촉진된다. 이는 알콕시기로부터 생산된 수산기의 존재로 필름 내부까지 물 분자가 침투하기 쉽게 되어 필름표면으로부터 내부에 걸쳐서 균일하게 분해가 일어나는 것으로 생각된다. 가수분해 후의 존재시료의 분자량 분포는 그림 8과 같다. P(3HBV) 단독필름에서는 분해 전후에서 분포의 변화는 보이지 않으나, TP20wt% 하이브리드에서는 분해 후에 분포가 저분자량 측으로 쉬프트 되고 있다. 이로써 TP의 하이브리드화로 가수분해가 표면분해기구로부터 괴상분해기구로 변화된 것으로 생각된다.
그림 9는 25℃에서의 각 시료의 미생물 분해시간과 BOD 생분해도에 관한 것이다. P(3HBV) 단독필름에서는 5일 이후 분해가 가속화되고, 15일 후에는 분해도가 73.7%였다. P(3HBV)에 TP를 첨가함으로서 분해도는 급격히 저하하고, TP20wt% 하이브리드에서는 15일 후에도 15.1%로 낮았다. 분해 15일 후의 고형물 중량 잔존율은 P(3HBV) 단독필름은 zero(0) 이었던 것에 반해 TP10wt%, 20wt% 하이브리드의 경우 각각 65.6%, 76.9%였다. P(3HBV) 매트릭스 중에 TP가 분자수준으로 혼합되어 있기 때문에 미생물이 하이브리드를 분해물로 인식하지 못하며, 그 결과 미생물이 배출하는 분해산소량이 감소하기 때문에 분해도가 저하하지 않나 생각된다.
4. 결언
용매 캐스트 법에 의해 P(3HBV)-TP 하이브리드 필름을 형성하였다. P(3HBV)-TP 하이브리드는 가교결합과 분해가 공존하고, TP는 분자수준에서 P(3HBV)와 혼합하고 있는 것으로 생각된다. 하이브리드 필름을 SBF에 침적한 결과 필름 표면에 많은 인산칼슘이 형성되었기 때문에 본 하이브리드는 우수한 생체활성을 갖고 있다는 것을 의미한다. TP 함유율 증가에 따라 알칼리 가수분해는 가속되고 미생물에 의한 분해는 억제되었다.
이상과 같이 P(3HBV)에 TP를 하이브리드화 함으로서 P(3HBV)의 특성개질을 위해 유용한 방법으로, 특히 생체재료로서의 이용을 기대할 수 있다. 또 다른 PHA에 대해서도 TP와 하이브리드화를 행함으로서 동일한 효과가 있을 것으로 생각된다.
참고문헌
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